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温故知新｜急性缺血缺氧及再灌注时胎鼠肾脏一氧化氮合酶体系的表达
发布时间：2024-12-11 浏览次数：49 返回列表点击上方蓝字“中华围产医学杂志” →选择关注| 点击右上角“···” → 选择“设为星标 ★ ” 
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引用格式：韩梅,李娟,高红,等. 急性缺血缺氧及再灌注时胎鼠肾脏一氧化氮合酶体系的表达[J]. 中华围产医学杂志,2005,8(01)：43-46.DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-9408.2005.01.0121、温故知新｜足月新生儿缺氧缺血性脑损伤神经病理 MRI评价 2、温故知新｜7硝基吲唑在缺氧缺血性脑损伤中的作用机制3、温故知新｜半胱氨酸蛋白酶1参与新生鼠缺氧缺血性脑损伤形成的研究 作者单位:110004 沈阳,中国医科大学附属第二临床学院小儿内科目的 通过研究急性缺血缺氧及再灌注时胎鼠肾脏一氧化氮(NO)的变化规律及与一氧化氮合酶(NOS)的关系,初步探讨急性缺血缺氧及再灌注时肾损伤的发病机制。 方法 胎龄21日胎鼠为研究对象,分为缺血缺氧10min、30min及缺血缺氧30min再灌注30min、2h、6h和24h组,应用硝酸还原酶法、免疫组化和 RT-PCR技术检测不同时间NO含量改变和NOS(内皮型eNOS和诱导型iNOS)活性及基 因 表 达。 结果 随缺血缺氧时间延长NO水平明显降低,缺血10min(22.65±4.01),缺血30min(17.04±2.99)与假手术组(25.26±3.05)相比,差异有统计学意义(P<0.01)。随再灌注时间延长 NO水平呈双向改变,于再灌注6h升高达高峰(29.78±2.18),再灌注24h仍维持较高水平(29.45±2.78,P<0.05)。正常时 eNOS和iNOS即位于近曲小管。随缺血缺氧及再灌注时间的延长,eNOSmRNA 含量逐渐降低,eNOS光强度逐渐升高,活性逐渐减弱,与假手术组相比,差异有统计学意义(P<0.01);iNOSmRNA含量及光强度改变与之相反,于再灌注6h后与假手术组差异有统计学意义(P分别<0.05和0.01)。 结论 急性缺血缺氧及再灌注时胎鼠肾脏 NO水平呈双相改变,参与肾损伤,其动态变化过程是 NOS体系综合作用的结果。【关键词】 再灌注损伤;一氧化氮;一氧化氮合酶;肾研究发现一氧化氮(NO)是一重要细胞内信使,具有多种生理功能,同时作为一种自由基气体,可形成多种毒性产物,继发组织损伤,故 NO具有双重性。一氧化氮合酶(NOS)是 NO合成的限速酶,是调节 NO的重要环节。对于在急性缺血缺氧及再灌注肾脏中NO的变化规律及NOS的表达,国内报道甚少。本研究以胎龄21日胎鼠为研究对象,应用硝酸还原酶法、免疫组化和 RT-PCR技术检测急性缺血缺氧及再灌注不同时间NO含量改变和NOS(eNOS和iNOS)活性及基因表达,以初步探讨缺血缺氧及再灌注时肾损伤的发病机制。孕21日 Wister大白鼠腹腔麻醉,下腹正中开腹,暴露双角子宫及供应子宫和卵巢的动静脉血管,以无创动脉夹钳夹一侧血管,造成急性缺血缺氧,达到时间后取下动脉夹行再灌注,对侧未钳夹宫角内胎鼠为对照组(假手术组)。模型达规定时间后,立即剖宫取鼠,断头处死,取出双侧肾脏。所取时间点为缺血缺氧10min、30min及缺血缺氧 30min再灌注30min、2h、6h及24h。硝酸还原酶法测定 NO含量时每个时间点取胎鼠14~15只,每两只胎鼠 的肾脏合为一个标本。NOS免疫组化检测时每个时间点取胎鼠4 只。RT-PCR测定时每2只胎鼠肾脏合为1个标本,每个时间点取胎鼠8只。1.NO测定采用硝酸还原酶法,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。NOS 免疫组化采用SABC法,一抗 (eNOS和iNOS)及即用型SABC试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。严格按说明书操作。2.RT-PCR检测 NOS(eNOS和iNOS)mRNA的表达:(1)总 RNA提取:用 Trizol总 RNA提取试剂按说明书操作。总RNA经紫外分光光度计测定OD260和 OD280,比值大于1.8。(2)反转录合成cD-NA第一链,条件如 下:65℃ 1 min、30℃ 5 min、35℃3min、40℃ 3min、45℃ 3min、50℃ 3min、55℃3min、60℃ 3min、65℃ 3min、98℃ 5min、5℃5min。(3)eNOS、iNOSPCR扩增,引物由北京奥科生物技术有限公司 合成,β-actin为内参照。eNOS:扩增片段 806bp,上 游 5′-TACGGAGCAG-CAAATCCAC-3′, 下 游 5-CAGGCTGCAGTC-CTTTGATC-3′。iNOS:扩 增 片段 418bp,上游 5′-CTACCTACCTGGGGAACACCTGGGG-3′,下游5′-GGAGGAGCTGATGGAGTAGTAGCGG-3′。eNOScDNA 、iNOScDNAPCR 扩增,条件分别为:94℃4min后94℃45s,53℃1min,72℃1.5min,共30个循环后70℃7min延伸和94℃3min后94℃40s,56℃40s,72℃1min,共32个循环后72℃7min延伸。3.统计分析:(1)NO 含量用均值±标准差 (x±s)表示。(2)NOS活性检测:每张片子于镜下随机选取5个视野,每个视野随机选取近曲小管2~3个,利用 美国 Universal imaging Porporation的图象分析系统,应用 metaMorph软件测定其光强度(intensity)。(3)eNOS、iNOS及 β-actin扩增产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下观察照相,ЩψX174/Hince为分子量标准,用凝胶成像分析系统(KodakDigitalScience)扫描扩增带,以内参照值标准化 eNOS和iNOS值,得到 eNOS和iNOS的相对含量。(4)所有数据用x±s表示,利用统计学软件 SPSS进行q检验。结 果
一、缺血缺氧及再灌注时胎鼠肾 NO含量变化 缺血缺氧及再灌注时胎鼠肾NO 含量见表1。缺血缺氧10min肾 NO含量与假手术组相比略有下降,但差异有显著性 (P>0.05);缺血缺氧 30min时 NO水平明显降低,不仅低于假手术组,且低于缺血缺氧10min组,差异有显著性(P<0.01)。再灌注组中再灌注30min及再灌注2hNO较无再灌注时略有升高,但仍显著低于假手术组 (P<0.05),再灌注6h明显升高,达高峰,再灌注 24h仍维持较高水平(P<0.05)。
二、缺血缺氧及再灌注时胎鼠肾 NOS活性改变 缺血缺氧及再灌注时胎鼠肾近曲小管eNOS和iNOS光强度值见表 2。正常时eNOS和iNOS即在近曲小管表达。缺血缺氧10min时eNOS光强度略有升高,但差异无显著性(P>0.05);缺血缺氧30min时其光强度明显增高,差异有非常显著性(P<0.01)。再灌注组则随再灌注时间的延长eNOS光强度升高显著,各组与假手术组相比均差异有非常显著性(P<0.01),且各组之间亦有差异。而缺血缺氧10min时iNOS光强度略有减弱,但差异无显著性(P>0.05);缺血缺氧30min时其光强度减弱亦不明显。再灌注组于再灌注6hiNOS光强度明显减弱,与假手术组差异有显著性(P<0.05),再灌注24h仍维持较低水平。 本平台学术内容仅供医学专业人员参考。除非特别声明，发送的所有内容不代表中华医学会和本刊编委会的观点。译文或摘译类文章，详细内容请参照原文全文。 |